Nei 25 dagen statyske ynkubaasje by 28°C liet laccase fan *Pleurotus ostreatus* NRC620 de heechste aktiviteit sjen yn it skimmelkultuermedium. De optimale pH- en temperatuerwearden foar dit enzyme wiene respektivelik 3.0 en 70°C. Nei 2 oeren ynkubaasje by 40°C en 50°C bleau de enzymeaktiviteit respektivelik 68.33% en 59.61%. Nei 2 oeren ynkubaasje yn sitraat-fosfaatbuffer (pH 7.0) bleau de enzymeaktiviteit op 100%. De tafoeging fan 10 mM MgSO₄ en CuSO₄ fergrutte de enzymeaktiviteit mei respektivelik sawat 21% en 35%, wylst NaCl, MnCl₂, KCl en CaCl₂ de enzymeaktiviteit ynhibearren. Mei it brûken fan ABTS as substraat wiene de kinetyske parameters (Km en Vmax) fan *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase respektivelik 1,99 mM en 16.217 μmol min−1 L−1. Enzymatyske behanneling fan appelsapmonsters fermindere sawol de pH as de viskositeit signifikant, en dizze reduksje korrelearre mei in tanimming fan 'e opslachtiid. Laccase-behanneling resultearre yn in lichte ôfname fan it totale fenolyske ynhâld fan appelsap, mar der waard gjin fermindering fan antioksidantaktiviteit waarnommen.
Yn 'e lêste jierren hawwe ûndersikers har rjochte op 'e tapassing fan griene biotechnology yn 'e fiedingssektor. Laccase is ien fan 'e nuttichste enzymen yn 'e fiedingssektor, en fynt tapassingen op gebieten lykas sapferwurking, bakken, wynstabilisaasje en it ferbetterjen fan 'e organoleptyske kwaliteiten fan fiedingsprodukten.1In protte hegere planten en mikroorganismen skiede lakkase út,2en skimmels lykas deuteromyceten, ascomyceten en basidiomyceten kinne ek laccase produsearje.3Laccase (EC 1.10.3.2) is in blauwe oksidase dy't molekulêre soerstof redusearret ta wetter mei in systeem dat bestiet út trije ferskillende koperatomen, wêrtroch ferskate fenolyske ferbiningen en aromatyske aminen oksidearre wurde. Tidens de produksje fan fruit- en grientesappen binne enzymatyske en net-enzymatyske brúnjen krityske saken.4Omdat dizze stoffen de kleur, smaak en aroma fan it sap negatyf beynfloedzje, moatte se fuorthelle wurde.5
Fan alle fruchten binne appels it meast konsumearre wrâldwiid en yn 'e Jeropeeske Uny. Yn 2019 stie de appelproduksje wrâldwiid op it tredde plak, mei mear as 87 miljoen ton.6Appels befetsje ferskate fenolyske ferbiningen, ynklusyf flavonoïden en fenolyske soeren lykas kafeezuur en chlorogene soer.7Omdat appelsap typysk yn syn dúdlike foarm konsumearre wurdt, geane sawat 50% oant 90% fan 'e fenolyske komponinten ferlern tidens it filtraasjeproses.8Tsjintwurdich kieze konsuminten meastentiids minimaal ferwurke produkten, lykas troebel appelsap mei in hege polyfenolynhâld. Fanwegen it hege fenolynhâld is dit type appelsap lykwols benammen gefoelich foar ferkleuring en fertsjustking.9Ferskate technologyen, ynklusyf waarmtebehannelingmetoaden lykas pasteurisaasje by 60–90 °C, wurde brûkt om it fertsjusterjen fan appelsap te ferminderjen of te foarkommen.10Lykwols, neffens ûndersyk fan Sauceda-Gálvez11, termyske ferwurking kin flechtige gemikaliën ferneatigje en de organoleptyske kwaliteiten fan appelsap beynfloedzje. Alternativen foar termyske ferwurkingsmetoaden omfetsje superkrityske koalstofdiokside, ultraviolette strieling, ultragelûd, hege hydrostatyske druk of homogenisaasje ûnder hege druk.12De effisjinsje fan dizze technologyen en de opbringst fan geskikte fruitsappen hinget ôf fan 'e brûkte parameters en produktkarakteristiken. Harren wiidfersprate gebrûk wurdt beheind troch hege kosten, negative effekten op 'e kwaliteit fan guon itenprodukten, of ûnfoldwaande enzyminaktivaasje.13,14
Laccase kin brûkt wurde om fruitsap te stabilisearjen en te ferdúdlikjen.15Gökmen et al.16Wy riede it gebrûk fan laccase oan foar it dúlik meitsjen fan fruitsap, om't it effektyf fenolyske ferbiningen ferwideret troch se om te setten yn polymeren of oligomeren dy't maklik fuorthelle wurde kinne troch elk ultrafiltraasjemembraan, wêrtroch appelsap in stabile kleur en dúdlikens behâldt oant seis wiken by 50 °C. Suvere *Trichoderma* laccase waard immobilisearre op aluminiumoxide-kralen en brûkt om selektyf smaakferbiningen te ferwiderjen dy't feroarsake binne troch mikrobiële fersmoarging fan appelsap.17
Sawat 80-90% fan 'e flechtige komponinten fan appelsap binne esters en aldehyden, dy't it sap in unyk aroma jouwe.18Lakkase fan *Trametes versicolor* waard immobilisearre op in goedkeape stipe makke fan natuerlike fezels fan jonge kokosnootskillen foar it klaringjen fan appelsap.19Eardere stúdzjes hawwe de stabilisaasje fan appelsap (kleur en troebelheid) ûndersocht mei gebrûk fan enzymfrije of immobilisaasjemetoaden, of yn kombinaasje mei ultrafiltraasje.5,19It effekt fan skimmellaccases op 'e fysyk-gemyske eigenskippen fan appelsap tidens opslach bliuwt lykwols ûndúdlik. Dêrom wie it doel fan dizze stúdzje om eksperiminteel te ûndersykjen nei de feroaringen yn 'e fysyk-gemyske eigenskippen, it ynhâld fan fenolyske ferbiningen en de antioxidant-aktiviteit fan appelsap nei behanneling mei skimmellaccases en twa wiken opslach yn 'e kuolkast. Laccases hawwe it fermogen om fenolyske ferbiningen te oksidearjen, wat se beloftefol makket foar gebrûk yn ferskate yndustriële prosessen, ynklusyf sapklaring. Dizze stúdzje ûndersocht laccases fan *Pleurotus ostreatus* NRC 620, mei de fokus op 'e ideale omstannichheden foar har aktiviteit en effektiviteit by sapklaring. Wylst ûndersyk nei oesterpaddestoelen (P. ostreatus NRC 620) noch beheind is, hawwe eardere stúdzjes enzymen út ferskate skimmelboarnen ûndersocht, lykas Trametes versicolor en Ganoderma lucidum. It doel fan dizze stúdzje wie om de potensjele tapassing fan dit enzyme yn 'e fiedingssektor te evaluearjen en syn unike eigenskippen te markearjen, benammen syn ideale pH en temperatuer.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) (ABTS) waard kocht fan Sigma-Aldrich (Kanada). Alle oare reagentia wiene fan analytyske kwaliteit.
It Microbial Culture Collection Center fan it Nasjonaal Undersykssintrum krige de bekende oesterzwammenstam NRC620. Nei subkultuer waard dizze stam opslein op ierappeldextrose-agar-skuorren by 4 °C. De metoade foar it tarieden fan it inokulum wie as folget: 10 dagen âld, folslein ûntwikkele mycelium waard ynokulearre op ierappeldextrose-agarplaten en ynkubearre by 28 °C. Nei 10 dagen waarden trije myceliumblokken mei in diameter fan 12 mm út it agarmedium helle mei in sterile metalen pons en pleatst yn 250-mL Erlenmeyer-kolven mei katoenen pluggen mei 50 mL sterilisearre kultuermedium (pH 5.0, lykas earder beskreaun troch Othman et al.20De kultueren waarden 18 dagen by 28 °C ynkubearre. De kultueren waarden doe filtere troch Whatman nr. 1 filterpapier, en de resultearjende supernatant tsjinne as de enzymboarne.
Laccase-aktiviteit waard bepaald mei ABTS as substraat. It reaksjemingsel (2 mL) befette 500 μL fan 0,3 mM ABTS (oplost yn 0,1 M natriumcitraatbuffer, pH 4,5) en de fereaske hoemannichte enzymmonster ferdund mei destillearre wetter.21,22Mei it each op it feit dat lakkase ABTS kin oksidearje by keamertemperatuer (28 °C ± 2), waard ABTS-oksidaasje bepaald troch it mjitten fan de tanimming fan absorbânsje by 420 nm (ε420= 36.000 sm-1 M -1) mei in Agilent Carry-100 UV-spektrofotometer. Ien ienheid laccase-aktiviteit wie nedich om 1 μmol ABTS per minuut te oksidearjen. De proteïnekonsintraasje waard bepaald mei de Bradford-metoade mei bovine serumalbumine as ynterne kontrôle.23,24
Nei it krijen fan it enzyme út 'e oesterpaddestoelstam NRC 620, waard de aktiviteit dêrfan metten by ferskate kultivaasje-yntervallen foar 25 dagen ûnder statyske omstannichheden by 28 °C.
Om it effekt fan temperatuer op lakkase-aktiviteit te bestudearjen, waarden eksperiminten útfierd yn it temperatuerberik fan 20 oant 90 °C. Foardat it enzym tafoege waard en de reaksje begon waard, waarden de buffer (0,1 M natriumcitraat, pH 4,5) en substraat (ABTS) mingd en 5 minuten ynkubearre by ferskate temperatueren. De termyske stabiliteit fan it enzym waard beoardiele troch ynkubaasje yn 0,05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) by respektivelik 40, 50, 60 en 70 °C foar 2 oeren. De oerbleaune aktiviteit waard doe beoardiele mei it ABTS-substraat.
It effekt fan pH op lakkase-aktiviteit waard beoardiele mei ABTS as substraat yn 0.1 M sitraat-fosfaatbuffers mei in pH-berik fan 2.5 oant 7.0. De enzymoplossing waard twa oeren by 40 °C ynkubearre yn 0.1 M sitraat- en Tris-buffers (pH 3, 4, 6 en 7) om pH-stabiliteit te beoardieljen. Restaktiviteit mei ABTS as substraat waard berekkene nei ynkubaasje.
De lakkase waard 10 minuten ynkubearre yn natriumfosfaatbuffer (0,05 M, pH 7,0) mei ferskate metaalionen (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, en Mn2+) by konsintraasjes fan respektivelik 2,5 mM en 10 mM. It substraat (ABTS) waard doe tafoege om de reaksje te begjinnen, en de relative aktiviteit waard beoardiele.
ABTS-oksidaasje troch lakkase by ferskate konsintraasjes (0.025–3 mM) waard metten by pH 4.5 om de kinetische parameters (Vmax en Km) te bepalen. De kinetischekonstantenfan 'e Michaelis-Menten-fergeliking waarden berekkene mei in Lineweaver-Burk-plot, dy't it omkearde fan 'e reaksjesnelheid as funksje fan substraatkonsintraasje plot. De kinetische konstanten waarden berekkene út 'e Lineweaver-Burk-plot mei de GraphPad Prism ferzje 6.01-software.
Nei it goed waskjen fan 'e appels mei kraanwetter, waarden se yn 'e helte snien en útperst mei in folslein automatyske Braun MP80 appelpers (makke yn Dútslân). It sap waard filtere troch fjouwer lagen tsiisdoek. Der waarden gjin enzymen tafoege oan 'e kontrôlegroep, wylst 2,0% lakkase (de meast effektive konsintraasje dy't testen is) tafoege waard oan farske tariede appelsap, dat doe twa wiken by 4 °C bewarre waard.
Titreerbere aciditeit (TA) en pH waarden bepaald neffens de metoade fan Boulton et al.al.27De pH fan elk stekproef waard metten mei in digitale pH-meter (JENWAY 3510 pH-meter). Titreerbere aciditeit (TA) waard berekkene op basis fan appelsoer mei de folgjende formule.
Wêrby't V en C respektivelik it folume (mL) en de konsintraasje (0,1 mol/L) binne fan 'e natriumhydrokside-oplossing dy't brûkt wurdt by de titraasje. K is de koëffisjint foar appelsoerkonverzje, gelyk oan 0,067, en W is de massa (g) fan appelsap.
De totale oplosbere fêste stoffen (TDS)-ynhâld fan alle sapmonsters waard bepaald mei in PAL-1 pocket-refraktometer (ATAGO, Tokio, Japan). Nei elke mjitting waard de optyske lens spield mei deionisearre wetter, en elk appelsapmonster waard trije kear test. De wearde foar elk monster waard berekkene troch it gemiddelde fan 'e trije mjittingen te nimmen. De gemiddelde ± standertôfwiking foar elk appelsapmonster waard ek berekkene troch it gemiddelde fan dizze resultaten te nimmen.
De viskoelastisiteit fan 'e appelsapmonsters waard beoardiele mei in rotaasjeviskosimeter (RV, Rheotest 2, Dútslân). It monster waard yn 'e "S2" silinder fan 'e viskosimeter pleatst. De skynbere viskositeit waard fertsjintwurdige troch de helling fan 'e skuorspanning tsjin skuorsnelheidskurve, dy't berekkene waard út 'e skuorspanning en de oerienkommende krommen by ferskate skuorsnelheiden (fan 1,00 oant 437,4 s⁻¹). De formule foar it berekkenjen fan 'e skynbere viskositeit is as folget:
Wêrby't η de skynbere viskositeit (cP) is, τ de skuorspanning (dyn/cm²), γ de skuorsnelheid (sec⁻¹) is, en (τ) wurdt berekkene mei de koppel- (α) en silinder- (Z) wearden mei de folgjende formule: τ = Z . α.
De brúnjende yndeks waard bepaald neffens de metoade fan Meidav et.al.29In sapmonster fan 10 ml waard sintrifugearre by 2750 xg foar 10 minuten. 5 ml fan 'e sapsupernatant waard mingd mei 5 ml 95% ethanol. De absorbânsje fan it mingsel waard metten by 420 nm mei in Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC).
Totale fenolynhâld (TPC) waard kolorimetrysk bepaald mei it Folin-Ciocalteu-reagens lykas beskreaun troch Boulton et al.[27In standertkromme fan gallussoer waard konstruearre foar konsintraasjes fan 0 oant 500 mg/L (r²= 0,997). Resultaten wurde útdrukt as gallussoer-ekwivalenten (mg GAE/mL).
Foegje 125 μL destillearre wetter en 2850 μL FRAP-oplossing ta oan 25 μL appelsap en lit it mingsel yn it tsjuster stean foar30min. Mjit dan de absorbânsje by 593 nm mei in Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). It FRAP-reagens waard taret troch it mingen fan 300 mM asetaatbuffer (pH 3.6), 20 mM izer(III)chloride, en 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) (oplost yn 40 mM HCl) yn in ferhâlding fan 10:1:1. In standertkromme waard generearre mei Trolox as standert (R²= 0.999), en de resultaten wurde útdrukt as μM Trolox/mL.
De antioksidantaktiviteit fan 'e behannele en net-behannele sappen waard bepaald mei de DPPH-metoade om har fermogen om DPPH-frije radikalen te fangen te evaluearjen.31Tsien mikroliter sap waarden mingd mei 1 ml fan in DPPH-oplossing (100 μM) yn metanol. Nei 30 minuten reaksje yn it tsjuster waard de absorbânsje fan it mingsel metten by 517 nm mei in Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). De resultaten waarden útdrukt as trolox-ekwivalenten (μM trolox/ml) basearre op in kalibraasjekurve (R2= 0.990).
De krigen gegevens lieten sjen dat in maksimale laccaseproduksje waarnommen waard yn NRC 620 oesterpaddestoelen oan 'e ein fan 'e 18e dei fan fermentaasje, mei in aktiviteit fan 1302 U/L. Dit tsjinne as basis foar it bepalen fan 'e optimale kultivaasjetiid foar laccaseproduksje (Ofbylding 1). Hoewol't de enzymproduksje tanommen mei tanimmende kultivaasjetiid, wie de tanimmingssnelheid net direkt evenredich mei de kultivaasjetiid; nei 21 dagen wie de enzymaktiviteit mar mei 90 U/L tanommen (nei 1390 U/L). Dêrom waard úteinlik 18 dagen keazen as de optimale kultivaasjetiid om de produktopbringst te balansearjen mei de ekonomyske foardielen fan ferhege kultivaasjetiid.
Effekt fan kultivaasjetiid op lakkase-opbringst yn Pleurotus ostreatus NRC 620. Trije (12 mm) skimmelmyceliumblokken waarden yn 50 ml steryl medium ynintingd en doe kultivearre by 28 °C foar ferskillende tiden.
Yn oerienstimming mei oare stúdzjes jouwe ús resultaten oan dat de ideale kultuerperioade om peak laccase-sekresje troch skimmels te berikken wierskynlik tusken 7 en 36 dagen leit.32Neffens Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 produsearre de heechste hoemannichte lakkase oan 'e ein fan 'e njoggende dei fan fermentaasje, mei in spesifike aktiviteit fan 1637 U/mg proteïne. Fierder hawwe Othman et al.34fûn dat *Trichoderma harzianum* S7113 in grutte hoemannichte lakkase ôfskiede op 'e fyfde dei fan kultuer. De lakkaseproduksjesnelheid berikte in pykaktiviteit op 'e fjirtjinde dei en naam doe stadichoan ôf.34Hoewol enzymsekresje ek foarkomme kin tidens de haadgroeifaze, piekt it meastentiids yn 'e tuskenfaze en wurdt it triggerd troch de konsumpsje fan in koalstof- of stikstofboarne.34,35
Hoewol laccase fan Pleurotus ostreatus NRC 620 hege aktiviteit sjen liet oer in breed temperatuerberik fan 50 °C oant 80 °C, tichtby de pykaktiviteit (69–98%), waard de maksimale aktiviteit waarnommen by 70 °C (Fig. 2a). Bûten dit temperatuerberik naam de enzymaktiviteit ôf by sawat 70 °C. Dizze resultaten suggerearje dat it enzym aktyf is by hege temperatueren, wierskynlik om't hege temperatuer de kinetyske enerzjy fan 'e reaksje fergruttet.
Effekt fan reaksjetemperatuer (a) en pH (b) op lakkase-aktiviteit yn *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperatueren fariearjend fan 20 oant 90 °C waarden berikt troch it mingsel foarôf te ynkubearjen by ferskate temperatueren foar 5 minuten foardat it enzym tafoege waard en de reaksje begon waard. It effekt fan pH op lakkase-aktiviteit waard beoardiele mei ABTS as substraat yn oplossingen mei 0,1 M sitraat-fosfaatbuffer oer in pH-berik fan 2,5 oant 7,0.
Neffens Ezike et al.al.33, de optimale temperatuer foar *Trametes polyzona* WRF03 laccase is 55 °C, wat itselde is as dy foar *Ganoderma lucidum*laccase36en fergelykber mei de optimale temperatuer (50 °C) foar *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakkase . Baldrian38merkt op dat, lykas foar oare lignine-ôfbrekkende enzymsystemen, it ideale temperatuerberik foar laccase tusken 50 en 70 °C leit.
De resultaten lieten sjen dat it enzym de heechste aktiviteit sjen liet by pH 3.0, mei in aktiviteit fan 94% by pH 3.5. It bleau lykwols aktyf oer in breed pH-berik fan 2.5 oant 7.0 (figuer 2b). Fierder liet it hegere aktiviteit sjen yn soere omstannichheden yn ferliking mei neutrale of alkalyske omstannichheden. De aktiviteit bleau teminsten 77% oer it pH-berik fan 2.5 oant 4.5, mar berikte mar sawat 38% by pH 7.0. De optimale pH foar lakkase fan *Trametes polyzona* WRF03 wie 4.533, wat itselde is as de pH foar lakkases fan *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, en *Trametes hirsuta* 41. Neffens de stúdzje fan Chairin et al.42, de optimale pH foar lakkase fan *Polymorpha f. sp.* WR710-1 is 2.2, wylst de optimale pH foar lakkase fan *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5.043 is. De bining fan hydroxide-anionen (lakkase-ynhibitor) oan de koperatomen fan T2/T3-lakkase kin de reden wêze foar de fermindere lakkase-aktiviteit ûnder neutrale of alkalyske pH-omstannichheden. Dit kin de ynterne elektronoerdracht fan it T1-sintrum nei it T2/T3-sintrum fersteure, wêrtrochbeheinendde enzymaktiviteit23,44
Troch it enzyme by ferskillende temperatueren te ynkubearjen, waard fûn dat sawol de ynkubaasjetiid as de temperatuer de stabiliteit fan it enzyme beynfloede. Opmerklik wie dat laccase fan *Trametes polyzona* NRC 620 in hegere stabiliteit liet sjen by 40℃ en 50℃, en nei 120 minuten respektivelik 68,33% en 59,61% fan syn earste aktiviteit beholden hie (figuer 3a). Yn tsjinstelling, ûnder deselde omstannichheden (40℃ en 50℃, 120 minuten), behold laccase fan *Trametes polyzona* WRF03 respektivelik 64,38% en 42,92% fan syn aktiviteit.33Krektoarsom, it ferheegjen fan de ynkubaasjetiid en temperatuer fermindere de stabiliteit fan *Trametes polyzona* NRC 620 laccase; Nei ynkubaasje by 60 ℃ en 70 ℃ foar 60 minuten, naam de aktiviteit ôf nei respektivelik 39,24% en 1,72% (figuer 3a). Yn oerienstimming mei de eksperimintele resultaten liet laccase fan *Trametes polyzona* WRF03 hegere stabiliteit sjen by 40 en 50 ℃ tidens it termyske behannelingsproses.33Likegoed, Lueangjaroenkit et al.al.37en foarsitter et.al.42rapportearre de stabiliteit fan lakkasen fan Trametes polyzona KURNW027 en Trametes polyzona WR710-1 by 50 °C foar respektivelik 1 oere. As in brûkbere biokatalysator dy't tapast wurde kin yn ferskate biotechnologyske fjilden, moat lakkase goede stabiliteit en prestaasjes hawwe oer in breed temperatuerberik.
Termostatyske stabiliteit (a) en pH-stabiliteit (b) fan lakkase fan *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatyske stabiliteit waard beoardiele troch de enzymoplossing te ynkubearjen yn 0,05 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0) by respektivelik 40, 50, 60 en 70 °C foar 2 oeren. pH-stabiliteit waard beoardiele troch de enzymoplossing te ynkubearjen yn 0,1 M sitraatbuffer en Tris-buffer (pH 3, 4, 6 en 7) by 40 °C foar 2 oeren. Restaktiviteit waard berekkene mei ABTS as substraat nei ynkubaasje.
Om de optimale omstannichheden foar gebrûk en opslach fan enzymen te bepalen, hawwe wy it effekt fan pH op 'e stabiliteit fan lakkase ûndersocht. Bleatstelling oan ferskillende pH-wearden beynfloede de stabiliteit fan 'e proteïnestruktuer signifikant, wêrtroch't de stabiliteit en aktiviteit fan it enzymmolekule beynfloede waard. De resultaten lieten sjen dat it enzym minder stabyl wie ûnder soere omstannichheden, wylst it bettere stabiliteit liet sjen by hegere pH-wearden (neutrale en alkalyske regio's). By pH-wearden fan 7.0, 6.0, 4.0 en 3.0 wiene de enzymretinsjesifers nei 120 minuten respektivelik sawat 100%, 62.54%, 52.39% en 11.14% (Fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03 lakkase liet hegere stabiliteit sjen by neutrale pH-wearden (5.5–6.5) en legere stabiliteit by soere pH-wearden (ûnder 4.0). Nei 120 minuten by pH-wearden fan 5,5, 6,0 en 6,5 wiene de enzymretinsjesifers respektivelik sawat 82%, 100% en 93%.33Khairin et al.42opmurken dat laccase fan Trametes polyzona WR710-1 stabyl wie yn it pH-berik fan 6.0 oant 7.0, wylst Sayed et al.45liet sjen dat laccase stabiler wie ûnder neutrale pH-omstannichheden. Laccase fan Cerrena unicolor liet lykwols ek stabiliteit sjen ûnder alkaline omstannichheden (pH 9.0).46De bestudearre lakkasen lieten hege stabiliteit sjen oer in breed pH-berik. Dit kin in wichtige eigenskip wêze foar yndustriële tapassingen.
Omdat guon metaalionen sawol stimulearjende as remmende effekten hawwe op enzymaktiviteit, moatte har effekten op enzymaktiviteit yn yndustriële tapassingen beskôge wurde. Dit is krúsjaal, om't metaalionen faak foarkommende miljeufersmoargjende stoffen binne dy't de stabiliteit en synteze fan ekstrasellulêre enzymen beynfloedzje kinne.47Om de effekten fan meardere metaalioanen op lakkase fan *Pleurotus ostreatus* NRC 620 te ûndersykjen, hawwe wy oerienkommende eksperiminten útfierd. Lykas te sjen is yn figuer 4, beynfloede it ferheegjen fan de metaalioankonsintraasje fan 2,5 mM nei 10 mM de enzymfunksje negatyf, ôfhinklik fan it type metaal dat brûkt waard. Bygelyks,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, enCu²⁺koe de enzymaktiviteit stimulearje en aktivearje, wylstNei⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, enK⁺koe de enzymaktiviteit remme. By in konsintraasje fan 10 mM wiene Cu²⁺- en Mg²⁺-ionen de machtichste aktivators fan laccase-aktiviteit fan *Pleurotus ostreatus* NRC 620, wat in aktivearringsgraad fan respektivelik sawat 34% en 20% oplevere. By in konsintraasje fan 10 mM wiene Ca²⁺-ionen lykwols de machtichste remmer fan laccase, wat de enzymaktiviteit mei sawat 60% fermindere.
It effekt fan metaalioanen op 'e aktiviteit fan Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. De laccase waard 10 minuten ynkubearre yn natriumfosfaatbuffer (0,05 M, pH 7,0) mei ferskate metaalioanen yn konsintraasjes fan 2,5 mM en 10 mM. De reaksje waard doe ynset troch de tafoeging fan it substraat (ABTS), wêrnei't de relative aktiviteit metten waard.
Us resultaten binne yn oerienstimming mei dy fan oare auteurs dy't fûnen dat Mg²⁺ en Cu²⁺ de aktiviteit fan *Trametes polyzona* WRF03³ ferheegje. Castaño et al.⁴⁸ fûnen dat laccase fan *Xylaria* sp. yn in beskate mjitte stimulearre wurdt troch koperionen (Cu²⁺). Fierder fierden Foroutanfar et al.⁴⁹ en Si et al.⁵⁰ ferlykbere stúdzjes út oer laccases fan *Paraconiothyrium variabile* en *Trametes pubescens*, respektivelik. De type II koperbindingsplak (T2) fan dit enzyme kin by in bepaalde konsintraasje mei Cu²⁺ verzadigd wurde, wat de stimulearring fan laccase-aktiviteit by hegere Cu²⁺³⁹-konsintraasjes kin ferklearje. Omdat laccases fan wite rotswammen oksidasen binne dy't meardere koperatomen befetsje, binne de effekten fan koperionen op laccase-aktiviteit ferskaat en fariearje fan stimulearjend en remmend oant neutraal.⁵¹ Yn tsjinstelling, Zhou et al.[52]rapportearre datCu²⁺ynhibearre de laccase-aktiviteit fan Taiwanese ûndergrûnske termiten (Odontotermes formosanus). Laccases fan Cerena sp. HYB07 lykwols[53]en Clitocybe maxima[54]waarden net beynfloede troch koperionen.
De substraatspesifisiteit waard fertsjintwurdige troch syn kinetyske parameters (Km en Vmax); hoe sterker de bindingsaffiniteit fan it substraat oan it enzyme, hoe leger de Km-wearde en hoe heger de substraatspesifisiteit.3,21,55De kinetische parameters (Km en Vmax) fan lakkase út *Pleurotus ostreatus* NRC 620 waarden bepaald mei GraphPad Prism 6.0 software troch it plotten fan 'e Lineweaver-Burk plot (Ofbylding 5). By it brûken fan ABTS as substraat wiene de resultaten 1,99 mM en 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,respektivelik. Elsayed et al.21rapportearre dat de Km-wearden foar ABTS-oksidaasje respektivelik 0,1 mM en 0,064 mM wiene, wat in hege affiniteit fan Lac A- en Lac B-isoenzymen foar ABTS oanjout. Fierder wiene de Vmax-wearden 0,182 μmolmin⁻¹en 0,603 μmolmin⁻¹, respektivelik. De krigen Km-wearde wie leger as dy fan Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); fierder wie harren Vmax-wearde (1429 mmol min⁻¹) eklegerby it brûken fan ABTS as substraat.33 Op deselde wize wiene de Km-wearden fan Lentinus squarrosulus MR13 en Trametes sp. AH28-2 laccase-konsintraasjes respektivelik 0,0714 mM en 0,025 mM, en de Vmax-wearden wiene 0,0091 mM min−1 en 0,67 mM min−1 mg−1 (relatyf oan ABTS), respektivelik.56,57
It effekt fan ABTS-konsintraasje op 'e aktiviteit fan lakkase fan *Pleurotus ostreatus* NRC 620 waard ûndersocht, en in Lineweaver-Burk-plot fan it omkearde fan 'e earste reaksjesnelheid tsjin ABTS-konsintraasje waard plot. De oksidaasjereaksje fan ABTS mei ferskillende konsintraasjes (0.025–3.0 mM) lakkase waard metten by pH 4.5 om de kinetische parameters (Vmax en Km) te bepalen. De kinetische konstanten fan Michaelis-Menten waarden berekkene mei de Lineweaver-Burk-plot fan it omkearde fan 'e reaksjesnelheid tsjin de substraatkonsintraasje. De kinetische konstanten waarden berekkene út 'e Lineweaver-Burk-plot mei de GraphPad Prism 6.01-software.
Tradisjonele ferdúdlikjende enzymen, lykas pektinasen, hydrolysearje pektinestoffen, wêrtroch't de viskositeit en troebelheid ferminderje. Se brekke effektyf strukturele polysachariden ôf en wurde faak brûkt yn kombinaasje mei oare enzymen, lykas cellulasen en hemicellulasen, om de opbringst en dúdlikens te ferbetterjen. Pektinasen rjochtsje har lykwols net spesifyk op fenolyske ferbiningen, dy't de wichtichste bydrage leverje oan troebelheid en oksidative brúnjen, benammen yn sappen lykas appel- en druvesap.58Yn tsjinstelling, katalysearje lakkases de oksidaasje fan fenolyske ferbiningen, en polymerisearje se yn gruttere, ûnoplosbere molekulen dy't fuorthelle wurde kinne troch sedimintaasje of filtraasje. Dit meganisme ferbetteret net allinich de dúdlikens, mar ferlingt ek de houdberens fan sap troch de kâns op oksidative brúnjen feroarsake troch fenolyske ferbiningen te ferminderjen. Fierder kinne lakkase-basearre klaringprosessen útfierd wurde ûnder mylde ferwurkingsomstannichheden (pH 3,5–5,5, temperatuer 25–40 °C), wêrtroch't se geskikt binne foar delikate sappen sûnder har fiedings- of organoleptyske eigenskippen yn gefaar te bringen.59Undersyk hat oantoand dat pektinasebehanneling sap yn 1-2 oeren dúdlik meitsje kin, wylst laccasebehanneling typysk in langere reaksjetiid (3-6 oeren) fereasket om fenolyske ferbiningen folslein te ferminderjen. Dit proses kin lykwols optimalisearre wurde troch it enzym te immobilisearjen of troch laccase te kombinearjen mei meganyske klarifikaasjemetoaden.60Yn dizze stúdzje liet enzymprofilering fan it rûge ekstrakt wichtige laccase- en α-amylase-aktiviteiten sjen, wylst pektinase- en xylanase-aktiviteiten ekstreem leech wiene, en cellulase-aktiviteit net waard waarnommen. Dêrom wie de fermindering fan troebelens en fenolynhâld benammen te tankjen oan de aksje fan laccase, wylst de feroaring yn viskositeit foar in part te tankjen wêze koe oan de aksje fan amylase.
Tabel 1 toant de fysykochemyske parameters fan farsk parse appelsap en lakkase-behannele samples. De resultaten lieten sjen dat de opbringst fan farsk parse appelsap (71,59%) leger wie as dy fan lakkase-behannele samples (87,34%). Dizze resultaten binne yn oerienstimming mei de befiningen fan Pilnik en Orange.61, dy't oanjûn dat it brûken fan enzymen yn fruitferwurking de sapopbringst ferheegje kin, de filtraasje ferbetterje kin en sap fan hege kwaliteit, dúdlik sap foar konsintraasje krije kin. De tanimming fan sapopbringst is benammen te tankjen oan de tanimming fan it gehalte oan oplosbere sûkers yn it sap. Tidens enzymatyske hydrolyse fan fruit wurde mesoglea en pektine yn 'e selwanden fan it produkt ferneatige en omset yn oplosbere stoffen lykas neutrale sûkers en soeren.62.De pH-wearde fan it mei enzymen behannele appelsap wie signifikant leger as dy fan 'e kontrôlegroep (P < 0,05), en de pH-wearde fan beide groepen naam signifikant ta tidens opslach (Tabel 1). Dizze resultaten binne yn oerienstimming mei dy fan Mark et al.63, dy't opmurken dat de pH fan cashewfruchtsap nei opslach nei waarmtebehanneling ôfnaam. Pektine-ôfbraak en galakturonzuurfoarming nei enzymbehanneling kinne ferantwurdlik wêze foar de tanimming fan 'e pH tidens opslach. De pH fan enzymbehannele samples bleau tusken 4,05 en 4,31 tidens de opslach, wylst de pH fan net-behannele appelsap tusken 4,12 en 4,33 lei.
De totale soerheid (TA) fan sawol ûnbehannele as lakkase-behannele samples liet in ôfnimmende trend sjen mei tanimmende opslachtiid (Tabel 1). De ôfname yn soerheid waard taskreaun oan de konverzje fan organyske soeren nei koalhydraten of enzymatyske reaksjes, lykas oksidaasje tidens sapopslach.64De totale soerheid fan 'e kontrôle-appelsap en mei enzymen behannele samples wie leger as dy fan oare sappen (ierdbeiensap 0,9%, prumesap 2,2%, kumquatsap 1,0%, abrikoazensap 2,4%, sinaasappelsap 0,8%), mar fergelykber mei dy fan oare sappen (bygelyks pearesap 0,3%).62Dizze ferskillen yn net-behannele farsk parse appelsap kinne te tankjen wêze oan ferskate faktoaren lykas groeiomstannichheden, genetyske faktoaren, rypingsnivo en ferwurkingsmetoaden.65De ôfname yn totale soerheid fan kontrôle- en laccase-behannele appelsap komt oerien mei de resultaten presintearre troch Singh et al.66oangeande de ôfname fan totale soerheid fan Jin Nuo-appelsap nei 74 dagen opslach. Oan 'e oare kant, Oshmiansky en Wojdylo67fûn gjin wichtige feroarings yn 'e soerheid fan appelsap by it bestudearjen fan it effekt fan tradisjonele klaringmetoaden.
De resultaten presintearre yn tabel 1 jouwe oan dat de wearde fan totale oplosbere fêste stoffen (TSS) fan it mei lakkase behannele appelsap heger wie as dy fan it net-behannele stekproef. Dizze resultaten binne yn oerienstimming mei de publisearre stúdzjes.. 68Fierder lit tabel 1 sjen dat de TSS-wearde fan 'e kontrôle-appelsapgroep 9,58 wie op it begjinpunt en 11,05 berikte oan 'e ein fan 'e opslachperioade. Dizze wearden binne leger as de TSS-wearden fan farske appelsap rapportearre troch Hamid et al.. 69(11.2 en 11.80, respektivelik). De TSS-wearde fan 'e mei laccase behannele appelsapmonsters naam signifikant ta, begjinnend fan 11.23 en berikte 12.93 nei twa wiken opslach by 4°C (Tabel 1). In ferlykbere tanimming fan TSS tidens opslach waard ek waarnommen yn sitrusfruchten, sitroenen en swiete sinaasappels. De tanimming fan totale oplosbere fêste stoffen (TSS) tidens opslach kin te tankjen wêze oan de hydrolyse fan polysachariden (setmoal) ta monosachariden (sûkers), de tanimming fan konsintraasje troch sapdehydrataasje, en de degradaasje fan pektine yn it sap ta oplosbere fêste stoffen. De tanimming fan totale oplosbere fêste stoffen (TSS) is wierskynlik te tankjen oan de tanimming fan oplosbere sûkers, dy't kinne wurde foarme troch de konverzje fan pektine of cellulose ta oplosbere sûkers troch pektine of cellulase, respektivelik, of troch de hydrolyse fan setmoal ta sûkers, lykas rapportearre troch Hamed et al.69.It effekt fan lakkase op 'e eigenskippen fan appelsap kin fisueel waarnommen wurde, om't lakkase-behannele appelsap in bettere streamberens en legere viskositeit sjen lit as ûnbehannele sap. Dizze observaasje is opnommen yn tabel 1; De viskositeit fan it mei enzyme behannele stekproef wie 1,87 cP, wylst de viskositeit fan it kontrôle-stekproef 2,95 cP wie. Dizze wichtige ôfname yn viskositeit is wierskynlik te tankjen oan de hegere wetterhâldende kapasiteit fan pektine-achtige stoffen en de foarming fan in gearhingjende netwurkstruktuer.
Yn dizze stúdzje waard it effekt fan lakkase op 'e brúnferkleuringsyndeks (BI) fan appelsap ûndersocht troch de absorbânsje te mjitten by 420 nm mei in spektrofotometer. De resultaten wurde werjûn yn tabel 1. Tidens opslach liet de BI fan appelsapmonsters yn sawol de behannele as de net-behannele groepen in stadichoan tanimmende trend sjen. BI reflektearret de graad fan brúnferkleuring en kin tsjinje asin wichtichyndikator fan enzymatyske en net-enzymatyske brúnferoaringsreaksjes. De absorbânsje naam signifikant ta tidens opslach (P < 0,05). Oan 'e ein fan opslach, deA420De wearde fan appelsapmonsters yn 'e kontrôle- en enzymbehannele groepen naam ta mei respektivelik sawat 217% en 121% (Tabel 1). De resultaten jouwe oan dat enzymbehanneling de brúningsgraad effektyf kin ferminderje mei sawat 56%. De resultaten fan Bezerra et al.[19] binne yn oerienstimming mei ús resultaten; Se brûkten laccase-glutaraldehyde-kokosnootvezel om appelsap te klarifjen, wêrtroch't de oarspronklike kleur mei 61% fermindere waard.
Hoewol polyfenolen yn fruitsappen positive fiedings- en terapeutyske effekten hawwe op it minsklik lichem, kinne se ek reagearje mei aaiwiten, wêrtroch't saptroebelheid, sedimintaasje of troebelheid ûntstiet, wêrtroch't de smaak en it aroma fan it produkt feroaret en de houdbaarheid ferminderet.71It doel fan dizze stúdzje wie om it fenolyske ferbiningsgehalte fan appelsap feilich te ferminderjen mei lakkase fan Pleurotus ostreatus NRC 620. De resultaten presintearre yn Tabel 1 litte sjen dat it totale fenolyske ferbiningsgehalte fan lakkase-behannele appelsap signifikant fermindere wie foar opslach by 4 °C. Fierder naam it totale fenolyske ferbiningsgehalte ek ôf tidens opslach yn beide bestudearre samples (Tabel 1). Undersyk troch Sandri et al.72liet sjen dat mei enzymen behannele appelsap syn antioksidantaktiviteit en fenolyske ferbiningen kin behâlde. De resultaten fan in stúdzje fan Lettera et al.73litte sjen dat behanneling fan sinaasappelsap mei skimmellakkase it gehalte oan fenolyske ferbiningen dêryn mei maksimaal 45% ferminderje kin.
Fenolyske ferbiningen hawwe oantoand eigenskippen te hawwen lykas it fangen fan frije radikalen, reduksje en lessen fan singlet soerstof, oerdracht fan wetterstofatoom, en elektrondonaasje oan frije radikalen, wêrtroch't se krêftige antioksidanten binne.74Dêrom waarden yn dizze stúdzje metoaden basearre op DPPH en FRAP brûkt om it effekt fan lakkase op 'e antioksidantaktiviteit fan appelsap dat 14 dagen yn in kuolkast opslein waard te evaluearjen (Tabel 2). Beide metoaden lieten in tanimming fan antioksidantaktiviteit sjen tidens opslach, wat mooglik te tankjen is oan 'e tanimming fan frije fenolferbiningen of de foarming fan Maillard-reaksjeprodukten (MRP's), wêrby't Maillard-reaksjeprodukten wierskynlik de oarsaak binne fan 'e tanimming fan antioksidantaktiviteit.75Net-enzymatyske brúnferoaringsreaksjes (ynklusyf askorbinezuurdegradaasje, Maillard-reaksjes en soer-katalysearre degradaasje fan sûkers) produsearje brune pigmenten (melanoïdinen). Tuskenlizzende askorbinezuurdegradaasjeprodukten en sûkerdegradaasjeprodukten (lykas karbonylferbiningen) kinne reagearje mei aminosoeren fia Maillard-reaksjes.76Hoewol't it brún wurden fan fruit en grienten tidens opslach wiidweidich bestudearre is, bliuwt ús begryp fan dizze reaksjes beheind.77Yn ferliking mei de FRAP-metoade liet laccase-behannele appelsap signifikant legere antioksidantaktiviteit sjen mei de DPPH-metoade (Tabel 2), en de antioksidantaktiviteit fan alle samples naam signifikant ta mei tanimmende opslachtiid. Twa ferskillende metoaden foar it bepalen fan antioksidantaktiviteit waarden brûkt yn dizze stúdzje, om't har prinsipes ferskille. De DPPH-metoade mjit it fermogen om frije radikalen te neutralisearjen, wylst de FRAP-metoade it fermogen mjit om izerionen te ferminderjen. Dêrom wurdt it oanrikkemandearre om meardere metoaden te brûken foar it bepalen fan antioksidantaktiviteit om de antioksidantaktiviteit fan 'e bestudearre samples better te begripen.78
Ien fan 'e wichtichste befiningen fan dizze stúdzje is dat *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 optimale aktiviteit fertoant by 70 °C en pH 3.0. Yn ferliking mei oare skimmellaccases dy't gewoanlik brûkt wurde foar sapklaring, lykas *Trametes versicolor* en *Ganoderma lucidum* laccases, fertoant *P. ostreatus* NRC 620 in hegere termyske stabiliteit en in soerdere pH. Lakkases fan *Trametes versicolor* en *Ganoderma lucidum* fertoane typysk optimale aktiviteit yn it berik fan 50-60 °C en by pH-wearden tusken 3.5 en 5.0. Dit ferskil kin bydrage oan ferbettere sapklaringseffisjinsje, foaral foar soere sappen wêr't stabiliteit by legere pH-wearden kritysk is. It unike skaaimerk fan *P. Yn ferliking mei oare bestudearre skimmellaccases, fertoant *Pleurotus ostreatus* NRC 620 it fermogen om effektyf te funksjonearjen ûnder mear útdaagjende omstannichheden. De hegere optimale aktiviteitstemperatuer suggerearret potinsjele foardielen yn yndustriële tapassingen, lykas fluggere reaksjesnelheden en fermindere mikrobiële fersmoarging. De lege pH, dy't goed geskikt is foar de soere aard fan in protte sappen, kin nuttich wêze yn sapklarifikaasjeprosessen. Dizze resultaten rjochtfeardigje fierdere ferkenning foar tapassing op grutte skaal, wêrtroch't *Pleurotus ostreatus* NRC 620 in libbensfetber alternatyf is foar tradisjonele skimmellakkaseboarnen. Yn ferliking mei eardere stúdzjes hawwe wy fûn dat de optimale temperatuer 60 °C is en de optimale pH 3.0. Nei reaksje by 60 °C foar 80 minuten behâlde *Ganoderma lucidum*-lakkase46% fan syn aktiviteit.79 Neffens Kurniawati en Nicelle80, *Ganoderma lucidum*-enzymen litte poerbêste oant matige stabiliteit sjen by 25 °C en pH-wearden fariearjend fan 5,0 oant 8,0, en stabiliteit by pH 6,0 en temperatueren fariearjend fan 10 oant 30 °C. Yn dizze stúdzje hawwe wy fûn dat de optimale pH en temperatuer foar enzymaktiviteit foar *Pleurotus ostreatus* respektivelik 3,0 en 70 °C wiene. Nei ynkubaasje by 40 °C en 50 °C foar twa oeren behâlde it enzym respektivelik 68,33% en 59,61% fan syn aktiviteit. Fierder liet Pleurotus ostreatus NRC 620-laccase hege aktiviteit sjen oer in breed temperatuerberik fan 50 °C oant 80 °C, en berikte hast maksimale aktiviteit (69%–98%), mei maksimale aktiviteit waarnommen by 70 °C.
Konklúzjend, oesterpaddestoellaccase NRC620, krigen ûnder statyske omstannichheden, liet optimale aktiviteit en stabiliteit sjen oer in ferskaat oan pH- en temperatueromstannichheden, en liet superieure stabiliteit sjen yn ferliking mei oare enzymboarnen. De tafoeging fan 10 mM MgSO₄ en CuSO₄ fergrutte de enzymaktiviteit mei respektivelik sawat 21% en 35%. By ferwurking ta appelsap ferlege it enzym de pH en viskositeit, wylst it fenolgehalte mar in bytsje ôfnaam tidens opslach.
De resultaten befêstigje it potinsjeel fan laccase yn 'e fiedingssektor, benammen yn drankferdúdliking. Troch spesifyk fenolyske ferbiningen ôf te brekken, ferminderet laccase net allinich troebelheid en ferbetteret it de dúdlikens, mar behâldt it ek de kwaliteit fan fruitsappen ûnder mylde wurkomstannichheden. Oars as tradisjonele ferdúdlikingsmiddels lykas gelatine, bentoniet en silikagel, genereart laccase gjin ôffal of ferwideret it noflike aroma's út dranken, wêrtroch it in miljeufreonliker en duorsumer opsje is. Fierder biedt laccase, yn ferliking mei oare enzymen en filtraasjemetoaden, in rjochte en kosten-effektive oplossing sûnder kompromis te hawwen oer de produktkwaliteit.
Kyomuhimbo, HD en Brink, HG. Tapassingen en immobilisaasjestrategyen fan koperhâldende lakasen; in oersjoch. Heliyon 9, e13156 (2023).
Pleatsingstiid: 15 desimber 2025